降解物-抗体偶联物（DAC），靶向降解新模式！

来源：药渡

撰文：雨巷少年    编辑：丸子

近年来，研究人员为了更有效地递送化疗药物，一些小分子-药物偶联物(SMDCs)和抗体-药物偶联物(ADC)已经被成功开发和探索。这些偶联药物不仅可以选择性给药，而且还提高了毒素的治疗指数。目前，通过将这种偶联概念与靶蛋白降解(TPD)结合起来的降解物-抗体偶联(DAC)领域已经出现，有效解决了PROTAC面临的PK特征、递送及脱靶等问题。本文，我们介绍了DAC的概念、应用和最新进展。

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背景介绍

众所周知，癌症治疗通常是基于化疗药物和靶向药物的疗法，因此需要药物细胞毒性和安全性两个方面的平衡。然而，即使靶向治疗也不总是只针对异常的癌细胞，这些非特异性毒性会导致治疗指数低和副作用等问题。而选择性的药物递送策略可以最大限度地减少总体脱靶效应。为了实现强效但有毒药物的高效递送，将抗体结合到靶向特定抗原的ADC策略是药物发现中新兴的模式之一。

近年来，靶向蛋白降解(TPD)技术，通常被称为靶向蛋白水解嵌合体(PROTACs)，已被广泛应用于药物化学领域，其在针对不可成药靶点以及克服耐药性方面具有巨大优势。PROTACs是一种能降解细胞内靶蛋白的异双功能分子。

然而，尽管TPD技术实现了不可成药致病靶蛋白的降解，但正常细胞和癌细胞之间仍然缺乏选择性，同样可能会引起脱靶毒性的问题。此外，PROTAC的物理化学特性通常与较差的DMPK性质和较低的生物利用度有关。因此，作为一种药物递送策略，降解剂-抗体偶联物DAC可能为TPD领域提供了新的机会。通过DAC策略，降解剂可以特异性地递送至癌症相关细胞（图1）。

图1.ADC与DAC

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PROTAC面临的挑战

PROTAC分子有三个部分:靶蛋白配体，E3泛素连接酶配体，以及连接这两个配体的连接链。通常，PROTAC不符合“类药五规则”特征，主要结构特征是(i)高分子量(600 - 1000 Da)， (ii)大极性表面积(PSA > 200 Å)， (iii) >5氢键供体，(iv) >10氢键受体，(v)溶解性差，(vi)渗透性差。由于这些物理化学性质，PROTAC通常具有较差的细胞摄取和生物利用度。

研究发现，药物递送系统可以显著改善PROTAC特性，并提高整体细胞渗透性和生物利用度。迄今为止，已经报道了多种方法来递送具有更高选择性的药物，如小分子药物缀合物(SMDC)、纳米载体和ADC等。这些药物递送体系有诸多优点，例如：

(i)克服PROTACs较差的生物利用度和DMPK特性

(ii)避免复杂化学配方策略(iii)提供有效的转运和改善的吸收限制

(iv)通过肿瘤特异性和组织特异性的传递，这些致病靶蛋白可以在改善的治疗窗口中有效降解。

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ADC和DAC

ADC和DAC的结构组成相似，主要由单克隆抗体、附着位点、连接子和药物组成（图2）。只是ADC的载药通常使用单功能小分子，DAC使用PROTACs。

图2. DAC与ADC的组成特征

研究表明，抗体是有效载荷(如小分子毒素和PROTAC)特异性结合和传递的关键成分，以杀死和降解靶蛋白。抗体的先决条件是(i)与具有较高肿瘤表达和有限正常细胞表达的明确抗原的特定相互作用;(ii)能够保持其特性，如稳定性、内化能力以及与连接链和有效载荷的结合;和(iii)对目标抗原的高度结合特异性。

连接链技术主要分为两类。第一类是具有三种释放机制的可切割连接链:溶酶体蛋白酶敏感(肽)、酸敏感(腙)和谷胱甘肽敏感(二硫)连接链。第二类是不可切割的连接链(硫醚和其他)，与可切割的连接链相比，不可切割的连接链在循环中表现出更好的稳定性。

此外，ADC和DAC的最后一个组成成分是有效载荷。ADC通常会释放小分子毒素，而DAC是为PROTAC和分子胶设计的。同样的原理也适用于ADC和DAC：选择性运输毒素或PROTACs，同时最大限度地减少脱靶效应。

ADC中的有效载荷具有更强的细胞结合亲和力。因此，有效载荷的数量(DAR，药物-抗体比)通常是4 - 8或2 - 6，这取决于偶联方法。相比之下，DAC所需的DAR高于ADC，因为PROTAC分子通常比ADC毒素具有更弱的效力。由于有效载荷的数量和连接链的化学性质，通常会出现聚集、低疗效和药代动力学问题。

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DAC作用机制

ADC和DAC的原理基本相同（图3）。在给药后，整个DAC应尽可能保持系统稳定，以防止PROTACs过早释放和血液循环。首先，DAC的抗体部分识别细胞表面的肿瘤相关抗原。其次，DAC -抗体复合物通过受体介导的内吞作用进行内化。在细胞内，复合物与核内体融合并被运送到活化的溶酶体。在蛋白水解和酸性环境下，复合物连接子被降解，负载物(PROTAC)随后被释放到细胞质中。根据DAC细胞内靶点，可诱导蛋白降解事件的发生。

图3.DAC的作用机制

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DAC研究现状

靶向BRD4的 DAC

研究表明，由于BRD4在癌症发展过程中作为转录和表观遗传调控因子的关键作用，引起了人们对新型BRD4降解物以及BRD4抑制剂的高度关注。第一个报道的DAC由一种靶向C型凝集素样分子-1 (CLL1)的单克隆抗体(mAb)和BRD4降解剂1 GNE-987组成。研究人员通过在BET结合片段上引入二氢吡咯吡啶酮支架，发现了一种用于急性髓系白血病(AML)的强效BRD4降解物1。尽管化合物1具有BRD4高效降解能力和较强的抗肿瘤细胞增殖作用，但体外和体内不利的DMPK特性影响了进一步的效果。

由于CLL1抗原在AML细胞表面高度表达，因此在AML异种移植模型中开发了一种新型靶向CLL1- DAC的方法。研究人员采用“直接二硫”偶联策略，使用含有活化的二硫键的甲硫磺酰(MTS)基团与CLL1靶向抗体上的6个半胱氨酸残基(DAR≈6.0)偶联，且没有显著的聚集问题（图4）。研究发现，通过抗体偶联策略增强了嵌合降解物，克服了不良降解物的药代动力学特性。此外，DAC 4的药代动力学评估显示了高水平的体内稳定性。

图4.靶向CLL1的BRD4 DAC的设计

STEAP1在前列腺癌中高度表达，靶向STEAP1的ADC也被报道在患者来源的前列腺癌模型中具有抗原依赖性的体内疗效。Dragovich等人利用化合物2作为BRD4的降解物和一种识别前列腺六跨膜上皮抗原(STEAP1)细胞表面抗原的抗体。最初，他们通过亚甲基烷氧基氨基甲酸酯部分将2连接到一个组织蛋白酶B可切割的拟肽连接物上，然后将该连接物与一个靶向SETAP1的单抗结合，以产生DAC 5a (DAR≈2.0)。  

遗憾的是，与降解物2相比，DAC 5a表现出较差的BRD4降解。此外，靶向CLL1的对照偶联物5b显示BRD4降解类似于5a。然而，通过进一步的“高DAR”策略得到了DAC 5c (DAR≈6.0)，与5a相比，DAC 5c的BRD4降解效果有所改善（图5）。然而，也有研究表明，连接更多的降解剂（高DAR）并不是开发更有效的DAC的最佳方法。

图5. 靶向STEAP1 的BRD4 DAC的设计

2020年，Maneiro等人报道了HER2依赖的BRD4降解的DAC。研究人员将降解物3 (ARV-771)偶联到靶向HER22的曲妥珠单抗(赫赛汀)。与此前DAC制备方法略有不同，他们利用无铜催化的叠氮-炔环环加成反应(SPAAC)将 PROTAC 3a与单克隆抗体连接而成，得到了一种新的DAC 12（DAR为4）。研究发现，DAC 12具有较好的稳定性，在HER2+细胞中显示出选择性降解BRD4蛋白（图6）。

图6.靶向HER2的BRD4 DAC的设计

靶向Erα DAC

除了靶向BRD4的DAC, Dragovich等人还报道了两种不同的er α靶向降解物13和15。降解剂13由选择性雌激素受体调节剂他莫西芬与连接酶配体XIAP组成，并显示出强大的降解Erα效果。

研究人员以他莫西芬的羟基为连接位点，使用缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧基连接链与HER2 单克隆抗体结合的他莫西芬羟基位点，得到了降解剂14（图7），并成功地证明了目标蛋白的降解。

图7.靶向HER2的Erα DAC

研究人员进一步用基于VHL配体的PROTAC 15，合成了新型的靶向HER2的Erα DAC。研究人员选用VHL的羟基为连接位点，将碳酸基二硫连接剂和焦磷酸二酯基连接剂应用于相应的DAC 16和17（图8）。然而，这些降解物表现出中等的稳定性，需要进一步优化提高稳定性。

图8.基于VHL配体的靶向HER2的Erα DAC

靶向BRM的DAC

BRM蛋白，也被称为SMARCA2，在包括癌症在内的各种人类疾病中被广泛发现。降解物20最初由Arvinas和Genentech于2019年开发，是BRM的选择性降解剂。后来，Genentech进一步开发了一个基于降解物20的DAC 21，主要通过使用二硫基连接链将降解物20和选择性结合CD22细胞表面受体的单抗进行共价连接（图9）。此外，后续异种肿瘤移植实验证明DAC 21可以实现BRM蛋白的高效降解和细胞抗原依赖性降解。

图9. BRM的DAC 21的设计

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小结

靶向蛋白降解技术作为一种新的研究策略，已显示出极大的临床潜力。然而，由于它们固有的理化特性，往往造成了较差的体内外效果。为了克服这些挑战，研究人员设计了不同的药物递送系统。

降解物-抗体DAC策略为PROTAC分子提供了更好的特性，如溶解度、细胞内积累、位点特异性分布和减少副作用。因此，DAC是药物化学中最有前途的新模式之一。但DAC仍有改进的空间，如提高靶点选择性和验证连接链和降解物与抗体之间的最佳位置等。总而言之，这种DAC的药物模式大大克服了PROTAC所面临的各种问题，有望成为一种治疗多种人类疾病的候选药物。

参考文献

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